Определяне на метод глюкозооксидаза
Определяне на концентрацията на кръвната захар - един от най-често се извършват биохимични изследвания в лаборатории.
метод оксидаза глюкоза за определяне на глюкоза в кръвта и урината Въз основа на глюкоза от окислителната реакция в присъствието на оксидаза ензим глюкоза за образуване на водороден пероксид, който от своя страна в присъствието на пероксидаза окислява ortotolidin да образуват цветни продукти; на глюкоза обещание концентрация на броя цветни продукти.
Тъй като методът на глюкозооксидаза има за цел да идентифицира точно глюкоза, не всички видове захари, тя се използва в диференциалната диагноза на следните заболявания:
Принципът на метода за определяне на глюкоза оксидаза глюкоза
Глюкоза в присъствието на оксидаза ензим глюкоза окислява Xia атмосферен кислород за да се образува по време на реакцията на водородния пероксид. Водороден пероксид в присъствието на пероксидаза ензим окислява ortotoluidin цвят форма свърже-TION, интензивността на цвета на която е пропорционална-niju съдържащ глюкоза. Този метод дава възможност да се определи нивото на глюкоза в кръвната плазма, серум и цереброспинална течност.
- плазма natschesertse
- новородено - 1.7-4.2
- деца от 6 седмици до 15 години - 3.3 - 5.4
- възрастни (мъже, жени) - 3.9 - 5.6
- серум natschesertse
- новородено - 2,6 - 4,2
- деца от 6 седмици до 2 години - 3.3 - 5.4
- възрастни (мъже, жени) - 3.9 - 5.6
Необходимите реагенти за определяне на глюкоза с глюкозна оксидаза
1. Натриев хлорид 9 г / л (изотоничен разтвор) се получава чрез участък-voryaya 0,9 грама натриев хлорид в 100 мл вода.
2. Цинков сулфат 50 г / л 5 г цинков сулфат разтвор (ZnSO4) се разтваря във вода, обемът се довежда до 100 мл.
3. Натриев хидроксид, 0.3 мол / л: получен чрез разтваряне на 1,2 г натриева основа в 100 мл вода, концентрацията се проверява чрез титруване (тя трябва да бъде 0.3N).
4. Ortotoluidin 1% разтвор: един грама продукт се разтваря в 100 мл абсолютен алкохол. Разтворът може да се съхранява в хладилник-участника в бутилка със стъклена запушалка няколко месеца. Били препарат търговски schiysya може да се пречисти чрез прекристализация, за която се разтваря в абсолютен етанол, се прибавя вода и утаените кристали се събират чрез вакуумно филтруване и се суши над калциев хлорид.
5. ацетатен буфер рН 4.8: Смесват се 4 части 0.25 М оцетна киселина (проверете титруване) и 6 части 0.25 М натриев ацетат (съдържащ 34 г CH3COONa X ZN2O в 1 литър).
6. глюкоза - сух медикамент активност 3000 единици / мг или по-голяма.
7. пероксидаза от хрян. 1 мг, разтворени в 5 мл ацетат буфер, могат да бъдат съхранявани в хладилник като не-дни.
8. Работно реагент: 80 мл ацетатен буфер се разтваря 2 мг глюкозна оксидаза и 1 мг пероксидаза, се прибавя 1 мл 1% разтвор ortotoluidina, разбърква се и обемът се довежда с буфер до 100 мл. Работният реактив трябва да бъде прозрачна, безцветна или имат малко по-зелен оттенък, в този случай, той е стабилен, когато се съхранява в студа. Ако интензитетът на цвета или няколко часа след готвене Начи-naet да се утаи, което означава, че ortotoluidin недостатъчно, но чиста, и трябва да се прекристализира.
9. калибриране глюкозни разтвори. Глюкоза предварително изсушени, но при температура от 37 ° С и се съхранява в ексикатор. Първо, изходен разтвор с концентрация от 50 ммол / л до 180 мг от материал, който се разтваря в 20 мл наситен зол-Pa (около 0.3% -ен) бензоена киселина. От този разтвор разтворите работни калибриране се получават съдържащи 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммол / л, което отнема 0.6; 1.2; 1.8; 2.4; 3; 3.6 и 4.2 мл от изходния разтвор се регулира с наситен разтвор на бензоена киселина до обем от 10 мл. Тези разтвори съдържат глюкоза при същата концентрация, при която е в кръвта, което улеснява изчисленията за калибриране.
Напредъкът в определяне на метода на глюкоза оксидаза
Тръбата за центрофуга е от 1,1 мл разтвор на натриев хлорид, 0,4 мл от разтвор на цинков сулфат и 0.4 мл 0.3 N разтвор на NaOH, разбърква; където гелът се образува много тънък употреба-пропорционално цинков оксид, той освобождава 0.1 мл кръв или прецени-ЛИЗАЦИЯ разтвор се разбърква отново и след 10 минути, центрофугира бързо ruyut при 3000 об. / мин за 10 минути.
Към 1 мл от супернатанта се добавя 3 мл обработка REA тивна и внимателно се разбърква.
Постепенно оцветяване започва да се развива, което при нормална стайна температура достига максимум след 13-15 минути, а след това постепенно да намаляват-гънки. Фотометрично винаги през същия период от време след добавяне на работния реагент в кювета с оптична дължина на пътя 1 cm с червен филтър (дължина на вълната 625 нм) срещу празна които дават едновременно с работните тестове, но вместо кръвта вземат физиологичен разтвор на натриев хлорид.
При получаването на GRA на калибриране-FIC вместо вземат кръвни проби от 0.1 мл от съответния разтвор за калибриране.
Изчисляване на нивото на глюкозата може да бъде проведено от пропорциите на правило или графика кал-rovochnomu за изграждане на които една ос-никой dyval концентрацията на глюкоза (ммол / л), и от друга - величие добре изчезване.
Бележки към метода за определяне на метода на глюкозооксидаза
1. Възможно е първо да се освободи кръвта от пипета-небето в изотоничен разтвор на натриев хлорид. и след това се добавя разтвор сулфа че цинк и NaOH.
2. При системна работа не е необходимо непрекъснато да се построи калибрационна крива във всички точки, достатъчно е таралеж-флуоресцентен обработка празна проба и 2-3 точки в диапазона 3-9 ммол / л, и пълното калибровъчната крива изградят само при смяна на реагенти или коване техники.